Laboratuvarda COVID-19 Tanısı

Özet: Geçtiğimiz haftayı günlük COVID-19 olgu sayılarını anlamaya çalışmakla, bu tartışmaları izlemekle geçirdik. Olgu, vaka, hasta gibi kavramları yeniden anlamaya çalıştık. Çok kafa karıştırıcı ve yorucu idi. Flash haber ise Donald Trump, COVID-19 PCR pozitifti. Bu yazının konusu bunlar değil. Sahada hekimlerle ilgili erken taburculuk, tanı da gecikme, tanıyı saklama, yanlış tanı koyma gibi birçok hasta şikayeti, COVID-19 PCR testlerine dayandırılmaktadır.

Elimizden geldiğince katıldığımız, izlediğimiz bilimsel toplantılarda, takip ettiğimiz bakanlık ve uzmanlık derneği bilgilendirmelerinde; bu testlerin yanlış negatif ve pozitif sonuç oranlarını, nedenlerini anlamaya çalışıyoruz. Tüm bu bilgileri kabaca özetlemek istedik. Eminiz, hatalar eksikler ilgili uzmanlarca düzeltilir. Bu “hasta şikayet yönetimi ve adli tıp konsültasyonu” uygulamamız için gerekli. Teknik nedenlerin ve hastalığın evresinin alınan örnek bölgeleri ile birlikte değerlendirilmesi; şikayete neden olan yanlış (-) ve (+) bulguları daha iyi izah etmemiz yanı sıra medikolegal savunma stratejimize yardım edecek. Bu bilgilerle, negatif PCR sonucu ile ameliyata alınan bir hastanın, ameliyat sonrası pozitif olduğu öğrenildiğinde ki sorunun, medikolegal değerlendirmesi objektif olarak yapılabilecektir.

Hastanelerin, COVID-19 test merkezlerinin doğru test sonuçları ve potansiyel koronavirüs hastalarının teşhisini sağlaması zorunludur. Teşhis hatası ölümcül olabilir. Yanlış teşhis, tıbbi uygulama hatası iddiasının temelini oluşturabilir. Ne yazık ki, PCR testi ve COVID-19 koronavirüs için kullanılan diğer testler % 100 doğru değildir. Yanlış negatiflikler ve yanlış pozitiflikler ciddi  problemlere yol açabilir.

SARS-CoV-2’nin yönetimi ve kontrolü için tanı kitlerinin rasyonel bir şekilde sahada kullanılması kritik önem taşımaktadır. SARS-CoV-2 için enfeksiyonun farklı aşamalarında en uygun tanı kitini seçmek çok önemlidir. Enfeksiyonun erken aşamasında düşük yanlış negatifliğe (yüksek hassasiyet) sahip nükleik asit bazlı tanı kitlerinin kullanılması son derece önemli iken, düşük yanlış pozitiflik (yüksek özgüllük) enfeksiyonun sonraki aşamalarında önem kazanmaktadır. SARS-CoV-2 enfeksiyonundan kurtulduktan sonra topluma güvenli bir şekilde dönebilecek kişileri belirlemek için de yüksek özgüllüğe sahip immünolojik test tabanlı kitlere sahip olmak kritik hale gelmektedir.

Coronavirus (koronavirus), lipid zarfa sahip tek zincirli bir RNA virüsüdür. Coronavirüsler daha önce, MERS (Middle East Respiratory Syndrome) ve SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome) adlı ölümcül enfeksiyonlara sebep olmuştur.

Bu virus enfeksiyonuna bağlı pnömoni salgını ilk kez Aralık 2019’da Çin‘in Wuhan şehrinde bildirildi. Dünya Sağlık Örgütü (DSÖ), 11 Şubat 2020’de bir açıklama yaparak, yeni korona virüse bağlı hastalığın adını COVID-19 olarak duyurdu.

11 Mart 2020 tarihinde 4000’den fazla insanın ölümüne yol açmasıyla (WHO(Dünya Sağlık Örgütü tarafından bu tarihte resmen pandemi olarak ilan edildi. Bu hastalığı kontrol etmek için;

1-Çok test yapıp hastaları izole etmek

2-Evde kalmak

3-Hijyen kurallarına dikkat etmek gerekliydi.

Bu üç kural içinde hakkında en az şey bilineni ise tanı testleri idi.

Bu yazımızda tanı testlerindeki güncel durumu değerlendireceğiz;

Genel olarak enfeksiyonların tanısı; enfekte hastada enfeksiyon alanından alınan uygun materyalde etkenin mikroskobik olarak gösterilmesi, üretilmesi, antijenlerinin veya nükleik asitlerinin tespitini sağlayan yöntemlerle konulabileceği gibi, hasta serumunda etkene karşı oluşan spesifik antikorların gösterilmesi ile dolaylı olarak da konabilir.

Salgınlar sırasında tanı testlerinin yaygın olarak kullanılması tüm ülkeler açısından yaşamsal öneme sahiptir. Ancak sayıdan da önce gereken yerde ve zamanında kullanılmalıdır. Etkili bir sürveyans sistemi içinde, vakaların bulunmasının yanında hızla filyasyon çalışması yapılarak kaynağın ve tüm temaslıların bulunması, uygun önlemlerle izlenmesi, yaygın test uygulamaları başarının anahtarıdır.

Tanı testlerindeki hedef alanı tanıyabilmek için kısaca virüsün yapısal özelliğinden söz etmeliyiz.

SARS-CoV-2, Coronaviridae ailesinin Betacoronavirus (alt cinsi Sarbecovirus) içinde sınıflandırılmıştır.30 kb genomlu zarflı, pozitif anlamda, tek sarmallı ribonükleik asit (RNA) virüsüdür. Virüs, mutasyon oranını nispeten düşük tutan bir RNA düzeltme mekanizmasına sahiptir. Genom, yapısal olmayan proteinleri kodlar (bunlardan bazıları replikaz transkriptaz kompleksini oluşturmak için gereklidir), dört yapısal protein (sivri uç (S), zarf (E), membran (M), nükleokapsid (N)) ve yardımcı proteinler. Virüs, hücre girişi için bir anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (ACE2) reseptörüne bağlanır. SARS-CoV-2, insanları enfekte ettiği bilinen yedinci koronavirüstür (HCoV).

SARS-CoV-2 enfeksiyonunun klinik görünümü asemptomatik enfeksiyondan şiddetli hastalığa kadar değişebilir. Ölüm oranları ülkeye göre farklılık gösterir. SARS-CoV-2 enfeksiyonunun erken laboratuvar tanısı, klinik yönetim ve salgın kontrolüne yardımcı olur. Tanı testi, virüsün kendisinin (viral RNA veya antijen) veya enfeksiyona (antikorlar veya diğer biyobelirteçler) karşı insan immün tepkisinin tespit edilmesini içerebilir.

SARS-CoV-2 enfeksiyonundan kuvvetle şüphelenilen hastalardan uygun örneklerin hızlı bir şekilde alınması ve bu hastalara doğru laboratuvar tanısı konması, hastaların klinik yönetimini ve enfeksiyon kontrol önlemlerini almak için iki önemli önceliktir. Yeterli örnek almanın, laboratuar analizinin ve sonuçların yorumlanmasının karmaşıklığı göz önüne alındığında, örnek alma, transfer, laboratuvar testlerinin eğitimli ve yetkin operatörler tarafından yapılması son derece önemlidir.

SARS-CoV-2 ile enfekte kişiler hiçbir zaman semptom geliştirmeyebilir (asemptomatik vakalar), çok hafif hastalığı olabilir veya orta-şiddetli COVID-19 enfeksiyonu geliştirebilirler. Viral enfeksiyon varlığı için en sağlam kanıt, virolojik testler yoluyla proteinler veya nükleik asitler gibi virüs parçalarının saptanmasından gelir. Enfekte kişilerde, viral nükleik asitler veya viral proteinler açısından semptomsuz (asemptomatik) veya semptom başlangıcından önce (pre-semptomatik) ve bir hastalık dönemi boyunca (semptomatik) pozitif olarak test edilebilirler. COVID-19 için semptomlar, hastalığın ilk ortaya çıkışında çok çeşitli olabilir. Bireyler çok hafif semptomlar, belirgin pnömoni, ateşli hastalıklar / sepsis ve daha az yaygın olarak gastroenterit veya nörolojik semptomlarla gelebilir. Vaka yönetimi için gerekliyse, hastalar klinik yönetim kılavuzlarında önerildiği gibi diğer patojenler açısından da test edilmelidir, ancak bu SARS-CoV-2 testini asla geciktirmemelidir. SARS-CoV-2’nin diğer patojenlerle ko-enfeksiyonları bildirilmiştir, bu nedenle başka bir patojen için pozitif bir test COVID-19’u dışlamaz ve bunun tersi de geçerlidir. Testler, yeterli hassasiyette testlerle yapılmaz veya uygun koşullar altında yapılmazsa, yanlış pozitif veya yanlış negatif SARS-CoV-2 sonuçları elde etme riski vardır.

Enfekte Hastaların Klinik Özellikleri

SARS-CoV-2 enfeksiyonundan sonra, genel inkübasyon süresi 1 ila 14 gün, genellikle 3-7 gündür. Enfekte hastaların ana klinik semptomları ateş, öksürük, balgam çıkarma, baş ağrısı, miyalji veya yorgunluk, nefes darlığı, ishal, bulantı ve kusmadır; vakaların% 10’unda gastrointestinal semptomlar rapor edilmiştir, bu diğer koronavirüslerde bulunandan daha yüksek bir orandır ; ancak bazı enfekte hastalar tipik semptomlar göstermez ve bu nedenle asemptomatik enfeksiyonu temsil eder.

Laboratuvar testleri açısından önemli olan nokta, enfeksiyonun farklı aşamalarındaki, popülasyonlardaki ve organlardaki viral yükler tutarsızlık göstermektedir. Çoğu hastada, başlangıçtan itibaren erken, progresif ve iyileşme aşamalarına kadar ki ortalama günler sırasıyla 4 (2-6) gün, 12 (7-19) gün ve 20 (10-33) gündür. Virüs ilk birkaç gün içinde replike olur , erken dönem ya da ilerleme aşamasında (yaklaşık 10 ⁴ -10 ⁷ kopya/ml)viral yük ile bir tepe noktasına ulaşır ve çoğunlukla 10⁴ kopya/ml’den daha az viral yüke ulaştığında iyileşme aşamasına geçer. Toplam virüs bulaşma süresi yaklaşık olarak 20 gündür. Bu nedenle, erken dönem ve ilerleyen aşamalardaki viral yük, iyileşme aşamasındakinden önemli ölçüde daha yüksektir. İncelenen farklı popülasyonlar arasında, yaşlı hastalarda viral yükün en yüksek olduğu bildirilmiştir.

Viral RNA en sık olarak nazofaringeal sürüntülerden, orofaringeal sürüntülerden, bronkoalveolar lavaj sıvısından (BAL), tükürükten, anal sürüntülerden ve serum örneklerinden tespit edilmiştir. Virüs atılımının klinik bulgular başlamadan önceki asemptomatik evrede de gerçekleşebildiği bilinmektedir.

Alt solunum yolu örneklerinde viral yük, üst solunum yolu örneklerinden daha yüksek olup özellikle bazı çalışmalarda bronkoalveoler lavaj sıvısında (BAL) %93 ve balgam örneklerinde %69 tespit edilmektedir. Üst solunum yolu örneklerinde en fazla pozitiflik tespit edilen klinik örnek burun sürüntüleridir (vakaların yaklaşık üçte ikisinde). Faringeal sürüntülerde hastaların ancak üçte birinde virüs varlığı gösterilebilmiştir. Özellikle akciğer bulguları olan bazı ağır hastalarda virüs sadece alt solunum yolu örneklerinde tespit edilebilmektedir. Solunum sistemi dışında virüs dışkı (yaklaşık %30 vakada) ve nadiren kan (%1 vakada) gibi diğer klinik örneklerde tespit edilebilir.

Genel olarak viral yük, solunum yolu örneklerinde (nazofaringeal aspiratlar / swablar, boğaz swabları, tükürük ve balgam dahil( yaklaşık 4.33 × 10⁴ RNA kopya/mL) solunum dışı örneklere göre (yaklaşık 7.06 × 10³ RNA kopya/ml) çok daha yüksektir(plazma, idrar ve dışkı / rektal sürüntüler dahil).

Bir çalışmada solunum yolundan alınan farklı örnekler için, balgamda tespit edilen viral yük, burun ve boğazda tespit edilenden daha yüksekti. Balgamdaki viral yükün 7.99 × 10⁴ kopya / ml olan faringeal sürüntüden yaklaşık 10 kat daha yüksek olan 7.52 × 10⁵ kopya / ml olduğu bildirilirken, nazal sürüntüdeki yük 1.69 × 10⁵ kopya / ml   idi.  

RS-Cov-2 Hastalarında Nükleik Asit ve Antikorların Zamansal Dinamikleri

Çoğu hastada enfeksiyon kuluçka dönemini, erken dönem, ilerleme dönemi ve iyileşme aşamalarını içerir. Viral nükleik asitler başlangıçtan 4-48 saat arasında tespit edilebilir. 10⁴ ila 10⁷ kopya/ml viral yükle 7.^–10. gün arası pik yapar.

Daha sonra çoğunlukla 10⁴ kopya/ml viral yükle düşerek iyileşme aşamasına geçer ve toplam shetting süresi ortalama 20 gündür. Ig M, raporlanan iki çalışmada başlangıçtan sonraki 5. günde ve 12. günde(medyan)tespit edilmiştir.  Ig G serokonversiyonu, başlangıçtan yaklaşık olarak 14. günde olur, ardından Ig M ve Ig G, iyileşme aşamalarında hızla artar.

Daha sonra Ig M, 10. günden 30. güne kadar kademeli olarak azalır, Ig G varlığı devam eder. Her enfeksiyon aşamasında, nükleik asitler, Ig M ve Ig G çeşitli konsantrasyonlar gösterir bu da enfeksiyon durumunu ve aşamalarını ortaya çıkarmak için moleküler ve serolojik testleri kombine eden test stratejilerini önermek gerektiğini düşündürür.

Bazı hastalarda viral RNA yalnızca birkaç gün saptanabilirken, diğer hastalarda birkaç hafta, bazen aylarca saptanabilir. Viral RNA’nın uzun süreli varlığı, mutlaka uzun süreli bulaştırıcılık anlamına gelmez.

Çeşitli çalışmalar, bulaştırıcılığın azalması ile semptom başlangıcından ve bitişinden itibaren  geçen gün sayısının artması, solunum sekresyonlarında viral yükte azalma, nötralize edici antikorlarda artış  bildirmektedir.

Solunum salgılarının bileşimi oldukça değişken olabilir ve örnekleme çabalarının yeterliliği de değişebilir, bu da bazen yanlış negatif PCR sonuçlarına neden olabilir. SARS-CoV-2 enfeksiyonundan kuvvetle şüphelenilen ve üst solunum yolu sürüntüleri negatif olan hastalarda, balgam veya bronkoalveolar lavaj gibi sekresyonlarında viral RNA saptanabilir. Dışkı veya rektal sürüntülerin, hastaların bazılarında SARS-CoV-2 RNA için pozitif olduğu gösterilmiştir, bazı çalışmalar bu pozitifliğin solunum yolu örneklerine kıyasla uzadığını düşündürmektedir. Bazı hastalarda, kan örneklerinde SARS-CoV-2 RNA tespiti bildirilmiştir ve bazı çalışmalar kandaki tespitin hastalık şiddeti ile ilişkili olduğunu öne sürmektedir, ancak bu potansiyel ilişki üzerine daha fazla çalışma gereklidir. Oral sıvı örneklerinde (örn. indüklenmiş tükürük) aynı hastadan alınan üst solunum yolu sürüntüleri örnekleriyle karşılaştırıldığında bildirilen saptama oranları büyük farklılıklar gösterir. Oral sıvı örneklerin değerlendirmelerinin hassasiyetindeki çarpıcı farklılıklar, potansiyel olarak toplama, taşıma ve saklama tekniklerindeki büyük farklılıkların yanı sıra farklı test popülasyonlarının değerlendirilmesinden kaynaklanmaktadır. SARS-CoV-2 nadiren konjunktivit belirtileri olan ve olmayan hastalarda oküler sıvılarda tespit edilebilir. Bazı çalışmalarda idrarda sınırlı sayıda hastada viral RNA tespit edilebilmiştir. Bir çalışmada semen örnekleri pozitif olan birkaç hasta bildirilmiştir.

MOLEKÜLER TESTLER

Dünya çapındaki klinik laboratuvarlarda SARS-CoV-2 enfeksiyonunun teşhisi, esas olarak viral nükleik asitlerin RT-PCR ile saptanmasına bağlıdır. RT-PCR testleri için, hedef bölge olarak hangi spesifik genlerin seçildiği çok önemlidir. SARS-CoV-2’nin E geninin, diğer koronavirüsler ile oldukça benzer olduğu gösterilmiştir; bu, birinci basamak tarama aracı olarak hizmet verebilecek bir durumdur; ek olarak, SARS-CoV-2, ORF1b (RdRp dahil), N ve S genleri yarasa ile ilgili diğer virüslerle düşük homolojiye sahiptir. Bunlar hedeflemeye değer görece spesifik genlerdir.

Klinik RT-PCR protokollerinde, tek hedefli ve çok hedefli testler yaygın olarak kullanılmaktadır. İlki, RT-PCR sisteminde virüsün tek bir gen bölgesini hedeflemek için bir primerin ve ilgili probların kullanımına atıfta bulunurken, ikincisi, ORF1ab ve N’yi hedefleyen reaktifler gibi çoklu primer setlerini ve bunlarla ilgili probları kullanır.

SARS-CoV-2, mutasyona eğilimli tek sarmallı bir RNA olduğundan, RT-PCR sistemindeki spesifik hedeflerin sayısının arttırılması test hassasiyetini artıracaktır. Bununla birlikte, primerler özel olarak tasarlanmazsa, PCR sistemindeki çoklu hedefler birbirini etkileyerek amplifikasyon verimini ve klinik duyarlılığı azaltabilir.

Özet olarak, RT-PCR protokolleri için uygun sayıda hedefin seçilmesi, saptama amacına, spesifik primer kullanımı ve performans doğrulama sonuçlarına bağlıdır.

Şu anda, SARS-CoV-2 için birçok RT-PCR protokolü FDA, EUA veya NMPA tarafından onaylanmıştır veya DSÖ web sitesinde listelenmiştir. Örneğin, Almanya’da geliştirilen SARS-CoV-2 için RT-PCR protokolünde, E genini hedefleyen primerler yarasa ile ilgili tüm koronavirüsleri tarayabilir ve RdRp ve N genleri için primerler özellikle SARS varlığını doğrulamak için kullanılmıştır.

CoV-2 için performans doğrulama sonuçları, RdRp genine dayalı testin N ve E genlerine dayalı olanlardan daha yüksek bir analitik duyarlılığa sahip olduğunu ortaya koymuştur. Amerika Birleşik Devletleri’nde, CDC SARS CoV-2, N geni için üç primere (N1, N2 ve N3) dayalı için RT-PCR protokolleri yayınlamıştır.

 Ayrıca, Roche Diagnostics’in Cobas 6800 testi, ORF1a ve E genlerini hedef alır ve hızlı, güvenilir sonuçlar sunabilir. ORF1a için spesifik primerler SARS-CoV-2 enfeksiyonunu doğrular. Çin’de reaktifler Çin CDC’sine göre esas olarak ORF1ab ve N genlerini hedef alır. Farklı primerlere dayalı protokoller hızlı bir şekilde geliştirilmiş ve onaylanmış olsa da, bu protokollerin kapsamlı bir performans doğrulamasının ve bu protokoller arasında karşılaştırmasının olmaması önemli bir boşluk olarak kabul edilir.

Son zamanlarda, bir çalışma sırasıyla Almanya ve CDC tarafından geliştirilen iki protokolü karşılaştırdı. Sonuçlar, N1, RdRp ve E bölgelerini hedefleyen testlerin analitik duyarlılığı ve özgüllüğünün diğer testlerden daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur.  Optimal teşhis, SARS-CoV-2 genomu üzerinde en az iki bağımsız hedefi olan bir NAAT testinden oluşur, ancak SARS-CoV-2’nin yaygın olduğu alanlarda, tek bir ayırt edici hedefle basit bir algoritma benimsenebilir.

Tek hedefli bir test kullanılırken, performansı etkileyebilecek mutasyonları izlemek için bir stratejiye sahip olunması önerilir. Özetle, SARS-CoV-2 genomunun özellikleri, hedeflenen gen bölgelerinin tasarımına ve moleküler analizler için performans doğrulamasına rehberlik edebilir.

SARS-Cov-2’yi Teşhis Etmek İçin Kullanılan Moleküler Testler

SARS-Cov-2’yi Teşhis Etmek İçin FDA, EUA, WHO Tarafından Onay Verilen    Moleküler Testlere Birkaç Örnek

30 Nisan 2020 itibarıyla FDA EUA ve NMPA tarafından onaylanan moleküler reaktifler ve DSÖ web sitesinde sunulan farklı ülkelerde / bölgelerdeki testler tabloya dahil edilmiştir.

Moleküler Testlerin Uygulanmasına İlişkin Bilgiler

1. Enfeksiyonun teşhisi klinik semptomlara değil, esas olarak pozitif viral nükleik asit test sonuçlarına bağlıdır; pozitif viral nükleik asit sonuçları veren asemptomatik kişiler potansiyel enfeksiyon kaynağı olabilir.
2. Moleküler analizler için örnek seçimi çok önemlidir. Solunum yolu örneklerinin viral yükleri BAL’da en yüksektir, bunu balgam, nazal sürüntüler ve faringeal sürüntüler izler; durum elverdiğince, yetersiz viral yükün neden olduğu yanlış tanıyı önlemek için örnek seçimine aynı sırayla öncelik verilmelidir.  Nazofaringeal sürüntülerin pozitif tespit oranı bir çalışmada 18 hastanın 14’ünde orofaringeal sürüntülerden daha yüksekti ve birincisinin PCR Ct değeri de daha düşüktü. Nazal ve faringeal sürüntü örnekleri, BAL ve balgam örnekleriyle karşılaştırıldığında daha düşük bir pozitiflik oranı göstermiştir. Ek olarak, yakın zamanda yapılan bir çalışmada, 205 enfekte hastadan toplanan 1070 farklı numunenin pozitiflik tespit oranı değerlendirildi;

BAL en yüksek (14/15,% 93)

Balgam (75/104, % 72)

Burun sürüntüleri (5/8,% 63),

Boğaz sürüntüleri (% 126 / 39,32),

Dışkı (% 44/53,% 29)

Kan (% 3 / 307,1)

İdrar (0 / 72,% 0) olarak saptandı.

Bu nedenle, hastalar için birden fazla örnekleme yöntemi benimsenebilir ve BAL veya balgam gibi yüksek pozitiflik oranlarına sahip örnekler tercihen seçilmelidir.

3. Oral nazofaringeal sürüntüden alınan negatif sonuç, hastaneden taburcu olmak için yeterli değildir. Klinik uygulamada, BAL’ı toplamak karmaşık prosedürler gerektirir ve tüm hastalar için uygun değildir. Birçok hastada yetersiz öksürük mevcuttur, bu nedenle balgam örneklemesinin uygulanabilirliği düşüktür. Bu nedenle, nazofarengeal ve orofaringeal sürüntüler, klinik testler için ana örnek türleri olarak kullanılır; ancak bu numuneler, düşük viral yükler nedeniyle moleküler testlerde negatif sonuçlar verebilir ve bu da yanlış tanıya neden olabilir. Nazofaringeal veya orofaringeal sürüntülerden elde edilen sonuçlar negatif olsa bile, virüs bağırsakta yerleşebilir veya iyileşen hasta yine de bir virüs taşıyıcısı olabilir. Sonuç olarak, negatif test sonuçları, taburculuk kararı için klinik semptomların yokluğu ile birleştirilmelidir ve belirli bir gözlem süresi esastır.
4. Şüpheli kişilerde farklı alanlardan numune almak veya enfeksiyonun farklı aşamalarında tekrar tekrar numune almak, yetersiz viral yüklerden kaynaklanan yanlış negatif sonuçları önleyebilir. Örneğin, dışkı örneklerinde virüs pozitifliği, ancak solunum yolu örneklerinde negatiflik bir enfeksiyona işaret edebilir. Bazı hastalarda göğüs BT bulguları pozitif olan bazı hastalar, ağız sürüntülerinde negatif PCR sonuçları olmasına rağmen ve ağız sürüntülerinden tekrar tekrar test yapıldıktan sonra, sonunda hepsinde enfeksiyon olduğu doğrulanmaktadır.

 Moleküler Testlerin Kalite Çalışması

Şüpheli vakaların RT-PCR ile teşhisinde, istenmeyen bazı durumlar ortaya çıkabilir:

(1) Yanlış pozitiflik: SARS-CoV-2 içermeyen bir örnekte virüs için pozitiflik saptanması;

(2) Yanlış negatiflik: Yeterli miktarda SARS-CoV-2 içeren bir örnekte virüs için negatif test sonucu

 (3) Yeterli olmayan bir SARS-CoV-2 testi; virüs için negatif sonuç verir; bu, radyografide şüpheli olan sonuçlarla tutarlı olmayabilir.

 Örneğin, bir grup şüpheli hastanın teşhisinde, boğaz swablarının RT-PCR’inden ve göğüs BT görüntülemesinden elde edilen pozitif oranlar, sırasıyla yaklaşık% 59 (601/1014) ve% 88 (888/1014) olmak üzere farklıydı. CT testi bazı yanlış pozitiflikler verebilse de, CT ile saptanan çok sayıda şüpheli vaka RT-PCR ile doğrulanamaz ve olası ciddi sonuçlarla, tanısal karışıklığa yol açabilir.

Özetle, bu üç farklı senaryo tanıyı ve klinik yönetimi yanlış yönlendirebilir. Kalite güvencesi, özellikle bu oldukça bulaşıcı virüs karşısında SARS-CoV-2 moleküler analizlerinin doğruluğunu ve güvenilirliğini artırmaya yardımcı olacaktır; bu nedenle, her klinik laboratuvarda sağlam kalite güvencesi uygulanmalıdır.

Moleküler Testlerde Kullanılan RNA ekstraksiyonuna alternatifler?

Geleneksel moleküler tanıda iş akışlarının çoğu, RT-PCR testi yapılmadan önce RNA ekstraksiyonu gerektirir. Bununla birlikte, COVID-19 salgını nedeniyle küresel ticari ekstraksiyon kitleri kıtlığı vardır. Nazofaringeal swablardan direkt RT-PCR, RNA ekstraksiyonuna acil veya geçici bir alternatif sağlayabilir, ancak RNA degradasyonu ve PCR inhibisyonu riskinin artması testte duyarlılığın kaybolmasına neden olabilir.

RNA kalitesini etkileyebilecek ve uygulamadan önce değerlendirilmesi gereken diğer faktörler, deterjanların eklenmesi, taşıma ortamı, kullanılan örneğin hacmi ve kullanılan polimeraz enzimidir. RNA ekstraksiyonu ihtiyacını atlayan alternatif yöntemleri düşünen laboratuvarlar, bu tür protokolleri iş akışına entegre etmeden önce, protokollerini kapsamlı bir şekilde test etmeli, fayda ve riskleri tartan bir risk değerlendirmesi mutlaka yapmalıdır.

Yanlış pozitiflik

Hatalı pozitif sonuçlar, esas olarak numuneler arasındaki çapraz kontaminasyondan veya önceki laboratuvar amplifikasyonundan kaynaklanan kontaminasyondan ve diğer virüslerin spesifik olmayan primerler nedeniyle çapraz reaksiyonundan kaynaklanabilir. Çözümler, klinik laboratuvar ortamını temiz tutmayı ve kontaminasyonu önlemek için numune taşıma ve saptama prosedürlerini standartlaştırmayı içerir.

Yanlış pozitif sonuçlara yol açan sistemik problemleri belirlemede etkili olabilecek bir yöntem olan analiz için her gün klinik örnekler arasına rastgele birkaç negatif kalite kontrol materyali (QCM) yerleştirilmelidir. Son olarak, SARS-CoV-2’nin benzersiz genomik bölgelerini hedefleyen primerlerin kullanılması, virüsü spesifik olarak tespit edebilir ve çapraz reaktiviteleri azaltabilir.

Yanlış Negatiflik

Yanlış negatif sonuçlar temel olarak güvenilir olmayan tespit reaktiflerinden ve standart olmayan test işlemlerinden kaynaklanır. Bazı testler, virüsü saptamak için viral genomun iki veya daha fazla bölgesini hedefler; bununla birlikte, farklı bölgelerdeki reaktiflerin hassasiyeti farklı olabilir veya bu farklı hedefler arasında rekabet meydana gelebilir, bu da yanlış negatifliklerle sonuçlanır.  RNA virüsleri güçlü genetik değişkenliğe sahip olduğundan, mutasyonların neden olduğu primerler ve hedef diziler arasındaki uyumsuzluklar, zayıf hedef tespit performansına ve yanlış negatifliklere yol açabilir. Testten önce inaktivasyon da düşünülmelidir ve yaygın yaklaşımlar termal ve kimyasal inaktivasyonu içerir.

Farklı testlerin saptama sınırı değişiktir ve saptama sınırının altındaki örneklerdeki viral yükler de negatif bir sonuca yol açar. Bir örnekteki yetersiz virüs, esas olarak yanlış örnekleme almak veya örnekleme tekniklerinden ve sonraki aşamalarında yanlış örnekleme sürecinden kaynaklanır. Bu sorunu çözmek için, numuneler öncelik sırasına göre alınmalı, mümkün olduğunca farklı enfeksiyon aşamalarında numune alınmalı veya çeşitli numunelerden (sürüntü, dışkı ve kan dahil) saptama yapılmalıdır.

Sonuç olarak, test kiti kalitesinin hızlı optimizasyonu ve standart işletim prosedürleri, yanlış negatiflik sorununu çözmek için en önemli önceliklerdir. İlk olarak, testlerin performans doğrulaması gereklidir. İkincisi, termal inaktivasyon yerine guanidin hidroklorür tamponunun seçilmesi, inaktivasyon gerekiyorsa, RT-PCR sonuçları üzerinde daha küçük bir etki gösterecektir.

Ek olarak, laboratuarların yanlış negatifliklerden kaçınmak için nükleik asit ekstraksiyon ve test prosedürünü standartlaştırması istenir. Sentetik SARS-CoV-2 RNA gibi pozitif kalite kontrol materyalleri veya pozitif örneklerden alınan örnekler, klinik örneklerin saptanmasında kullanılmalı ve laboratuvarlar, test yeterliliğini geliştirmek için dış kalite değerlendirmesine katılmalıdır. Son olarak, RT-PCR ve serolojik testler, yanlış negatiflikleri azaltmak için kombine edilmelidir.

Test sonuçlarının şüpheli olduğu ortaya çıktığında, hastadan yeniden örnek alınmalı ve yeniden test yapılmalıdır. Hastadan yeniden örnek alınamıyor ise, RNA orijinal örneklerden yeniden ekstrakte edilmeli ve çok deneyimli personel tarafından yeniden test edilmelidir. Sonuçlar, viral yük yeterince yüksekse, alternatif bir NAAT testi ile doğrulanabilir. Laboratuvarlardan, beklenmedik sonuçlar için referans laboratuvar onayı almaları istenir.

Bir veya daha fazla negatif sonuç, SARS-CoV-2 enfeksiyonunu mutlaka dışlamaz. Aşağıdakiler dahil bir dizi faktör, enfekte bir kişide negatif bir sonuca yol açabilir:

– Çok az hasta materyali içeren numunenin kalitesizliği

– Örnek hastalık seyrinde geç toplanmış veya örnek, o anda virüsü içermeyen bir vücut sıvısından alınmışsa

– Numune uygun şekilde işlenmemiş ve / veya gönderilmemişse

– PCR inhibisyonu veya virüs mutasyonu gibi testle ilgili teknik nedenler

SEROLOJİK ANTİKOR TESTLERİ

SARS-CoV-2 enfeksiyonunda, RBD, S ve N proteinleri, IgA, IgM ve IgG antikorları üreterek vücudun bağışıklık tepkisi için ana antijenlerdir. IgA titresi, SARS-CoV-2’ye karşı mukozal bağışıklık tepkisini gösterir. IgM, akut enfeksiyöz aşamayı gösterirken, IgG, enfeksiyonun veya önceki enfeksiyonun orta ve ileri aşamalarını temsil eder.

Farklı çalışmalarda sunulan SARS-CoV-2’ye karşı antikorların zamansal dinamikleri biraz tutarsız olabilir ve bu konuda IgA, IgM ve IgG’den daha az rapor edilmiştir. Bir çalışmada, IgA ve IgM  her ikisi de ortalama 5. günde  tespit edilmiştir. IgG ortalama 14. günde  ortaya çıktığı rapor edilmiştir. Başka bir çalışmada ise; IgM ve IgG için medyan serokonversiyon sürelerinin sırasıyla 12. gün ve 14. gün olduğu bildirilmiştir.

Daha sonra, antikor seviyeleri hızla arttığı; IgA düzeyinin 21. günden sonra artmadığı bildirilmiştir. IgM seviyesinin yaklaşık 15. günden sonra önemli ölçüde artmadığı ve 10. günden 30. güne kadar mevcut olduğu; ve IgG seviyesinin de 21. günde plato yaptığı rapor edilmiştir.  Bu zaman süreçleri ışığında, IgM ve IgG’nin serolojik analizi, enfeksiyonun aşamalarını belirleme ve hastalık epidemiyolojisini değerlendirme açısından çok önemlidir.

Şu anda, temel olarak IgM ve IgG uygulamalarını içeren bazı antikor kitleri klinik uygulamalar için onaylanmıştır. Klinik uygulamada, RBD antijenine dayalı antikor testlerinin özgüllüğü% 90’a ulaşabilir ve SARS-CoV-2 ile SARS-CoV arasındaki çapraz reaksiyon sınırlıdır. S antijenlerine dayalı tespitte, S1 antijeninin SARS CoV dışındaki koronavirüsler için % 100 özgüllüğü vardır ve S antijeninden daha spesifiktir çünkü ikincisi MERS-CoV ile çapraz reaktiviteye sahiptir.

Bu fenomen, S2 alt biriminin S1 alt biriminden daha korunmuş olmasıyla açıklanabilir. SARS-CoV’ye ek olarak, MERS-CoV ile çapraz reaktivite de N proteinine dayalı testlerde bulunmuştur. Bu nedenle, RBD ve S1, antikor deneyleri için S ve N antijenlerinden daha spesifik antijenlerdir.

SARS-Cov-2’yi Saptamak İçin Kullanılan Bazı Serolojik Antikor Testleri

30 Nisan itibarıyla FDA, EUA ve NMPA tarafından onaylanan serolojik reaktifler tabloya dahil edilmiştir. Pozitif ve negatif agreement (%) verileri, her bir serolojik testin sonuçları ile RT-PCR sonuçları karşılaştırılarak belirlenen reaktiflerin talimatlarından oluşmaktadır.

Serolojik Testlerin Uygulanması ve Kalite Güvencesi

Antikorlar, enfeksiyonun durumunu gösteren SARS-CoV-2’ye karşı konağın humoral tepkilerini gösterir. Bu nedenle, serolojik antikor testleri, şüpheli vakaların teşhisinde moleküler testlerle birlikte veya negatif nükleik asit sonuçları olan şüpheli vakalarda ek testler  olarak kullanılmalıdır. Ayrıca, SARS-CoV-2’nin S ve N proteinlerine karşı IgG ve IgM seviyelerinin virüs nötralizasyon titresi ile ilişkili olduğu bulunmuştur.  Hastaların prognozunu ve iyileşmesini değerlendirmek için antikor titreleri önemlidir.

Serolojik antikor testleri, SARS-CoV-2 ile enfeksiyonların dinamiklerinin analizini sağlar; daha da önemlisi, operasyonel gereksinimleri daha düşüktür ve solunum yolu örneklemesi nedeniyle sağlık personelinin virüse maruz kalma riskini azaltabilir.

Serolojik testlerin avantajlarına rağmen, antikor testlerinin test performansı da dikkate alınmalıdır. SARS-CoV-2 ile enfekte olmuş ve enfekte olmamış bireylerden sırasıyla 397 ve 128 kan örneğinin analizinde; IgM / IgG testlerinin duyarlılığı ve özgüllüğü sırasıyla% 88.66 ve % 90.63 bulunmuştur. Bu nedenle, yanlış pozitifliklere ve yanlış negatifliklere yol açan bazı durumlar hala dikkat gerektirmektedir. Diğer koronavirüs alt türleri ile çapraz reaksiyon bir sorun olabilir. Antikor testleri, romatoid faktörler, heterofilik antikorlar vb. etkisine duyarlıdır. Diğer virüslerle çapraz reaktiviteyi azaltmak için reaktiflerin antijen peptidinin özgüllüğünü arttırmak ve numuneleri seyreltmek ve enzim etiketli antikorları değiştirmek yanlış pozitifliklerin insidansını azaltabilir. Ek olarak, yanlış pozitiflikleri en aza indirmek ve tanı için antikor testleri, klinik semptomlar ve moleküler sonuçların bir kombinasyonu kullanılmalıdır.

Yanlış negatif sonuçlar da dikkat gerektirir. Serolojik antikor tespiti için spesifik test pencereleri vardır; IgA ve IgM genellikle kısa bir süre dayanır ve IgG daha geç dönemde üretilebilir, bu nedenle uygun olmayan aşamalarda örnekleme yanlış negatifliklere yol açabilir. Bireysel bağışıklık tepkisi ve antikor üretimindeki farklılıklar da yanlış negatif sonuçlara yol açabilir. Bu nedenle, negatif RT-PCR sonucu ile birlikte farklı zamanlarda en az iki seroloji sonucu yanlış negatiflikleri ekarte etmeye yardımcı olur.

Test stratejisi de önemlidir; kombine IgM-IgG testinin sadece IgM veya IgG testlerinden daha pratiklik ve duyarlılığa sahip olduğu bildirilmiştir. Ek olarak, bazı laboratuvarlar örnekleri nükleik asit testinden önce inaktive ederler, ancak antikor testinden önce örneklerin inaktive edilip edilmeyeceği konusu tartışmalıdır. NMPA (National Medical Products Administration) tarafından onaylanan veya dünyada mevcut olan diğer antikor tanı kitleri talimatları herhangi bir inaktivasyon bilgisi içermez. Teorik olarak, termal inaktivasyon, antikorlar protein olduğundan antikor testini etkileyebilir, ancak etki kitlere ve test prensiplerine özgü olabilir.

Sorunlu Noktalar

PCR-Örnek kalitesinde sorun, hastalığın çok erken veya çok geç döneminde örnek alınması, inhibitör varlığı, transport sorunu, genetik mutasyon gibi nedenler yanlış negatif sonuçlara yol açabilir. Reaktiflerdeki herhangi bir kontaminasyon ya da teknik bir hata yanlış pozitif PCR sonucuna yol açarak tanıyı güçleştirebilir.

KLİMUD’un -Yetkilendirilmiş Covıd-19 Laboratuvarlarında Yaşanan Deneyimler 11.09.2020 Web Çalıştay Raporu’nda  da belirttiği gibi, halen ülkemizde yapılan PCR testleriyle ilgili; Sık değişen kitler, versiyonlar, lotlar, sahada birbirinden çok farklı örnek taşıma tüplerinin kullanılması, sarf malzemesindeki devamlılığın sağlanamaması, testte non-spesifik ışımaların çok olması, değerlendirmede düşük pozitif sonuçlarla yalancı ışıma olan negatif sonuçların ayırt edilmesinde arada kalınmasına neden olacağı bildirilmiştir.

Ham veri incelemesi ve sigmoidal olmayan eğrilerle ilgili çeşitli düzeltmelerle sonuç verilmeye çalışılmasına rağmen bazı zorluklar yaşandığı görülmektedir. Kitlerin analitik duyarlılığı, tekrarlanabilirliği ile ilgili sorunlar olduğu bildirilmektedir. İyi bir ekstraksiyon kitine ihtiyaç bulunduğu, LBYS-HBYS sistemi, sonuçların bu sistemlere gönderilmesinde sorunlar olduğu belirtilmektedir.

Antikor Testleri- Erken tanıda tek başlarına uygun değildirler. Virüsle enfekte olan herkeste antikor yanıtı oluşup oluşmadığını da henüz kesin olarak bilmiyoruz. Yalancı pozitif ve yalancı negatiflikler(çok sorunlu gereksiz bir güven yaratır).  Diğer korona virüslerle çapraz reaksiyon olabilir. Çok daha fazla çalışmaya gereksinim vardır.

SONUÇ

SARS-CoV-2 salgını dünya çapında yayılıyor. Doğru tanı testleri, enfekte kişilerin zamanında tespit edilip tanımlanması için yol göstericidir. Bu SARS-CoV-2 bulaşını önlemenin anahtarıdır. RT-PCR, laboratuvarlarda SARS-CoV-2 enfeksiyonunun moleküler teşhisinde yaygın olarak kullanılmaktadır ve serolojik antikor testleri ek yöntemlerdir. Her iki yöntem de SARS-CoV-2’nin özelliklerine göre tasarlanmalıdır. ORF1ab, N ve S genlerini içeren gen bölgeleri, RT-PCR için yaygın olarak hedeflenen bölgelerdir ve RBD, S1, S ve N proteinleri veya sentetik antijenler, serolojik deneylerde antikorları saptamak için kullanılabilir. BAL tipik olarak en yüksek viral yüke sahiptir, bunu balgam, nazal sürüntüler ve faringeal sürüntüler izler.

Viral nükleik asit ve antikor konsantrasyonlarının, enfeksiyon seyrinin farklı aşamalarında çok farklılıklar göstermesi, enfeksiyonun mevcut durumunun moleküler ve serolojik testlerin kombine kullanılarak belirlenebileceğini düşündürmektedir. İnkübasyon döneminde ve erken enfeksiyon aşamasında, solunum yolu numuneleri moleküler tanı(RT-PCR) için kullanılmalıdır; ilerleyen aşamalarda hem moleküler hem de serolojik testler tanı için faydalıdır; iyileşme aşamasında, enfeksiyonu belirlemek için serolojik testler kullanılmalıdır. Klinik tabloyla tutarsız RT-PCR sonuçları için, farklı organlarda örnekleme veya farklı aşamalarda tekrar tekrar örnekleme, yetersiz viral yükler nedeniyle olumsuz sonuçları önleyebilir.

Özellikle SARS-CoV-2’nin güvenilir tespiti için testlerin kalite kontrolçalışmaları gereklidir ve her laboratuvar test yeterliliğini geliştirmek için kalite güvence önlemleri mutlaka almalıdır. Sonuç olarak acil kullanım onayına sunulan birçok testin kaçınılmaz yetersizliklerinin sorumlusu hekimler olamaz. Bu konuda web sayfamızda bulacağınız çok sayıda COVID-19 pandemisi ve hekim sorumluluğu ile ilgili yazı konuyu açıklayacak niteliktedir.

SARS-CoV-2’nin genomik özelliklerinin, aktarımının ve klinik özelliklerinin tam olarak anlaşılması, daha iyi moleküler ve serolojik testlerin üretimine yol açacaktır. Halk sağlığını ilgilendiren acil bir durumda, oldukça hassas yöntemler tercih edilmelidir.

Çalışmalar, RT-PCR’nin COVID-19’un belirli aşamalarında CT görüntülemeden daha az duyarlı olabileceğini göstermesine rağmen, özgüllüğü SARSCoV-2’yi tespit etmek için onu diğer yöntemlerden üstün kılar. Viral salgınlarla savaşmak için rasyonel olarak spesifik olan teşhis yöntemlerini seçmek kritik önem taşır.

Tanıda herhangi bir eksiklik yıkıcı sonuçlara yol açabilir. Wang ve ark. SARS-CoV-2 enfeksiyonunu daha güvenilir bir şekilde teşhis etmek için RT-PCR’yi antikor testleri gibi diğer yöntemlerle kombine kullanmayı önermiştir. To ve ark. tükürük örneklerinin RT-PCR’de kullanım için daha umut verici olduğunu ortaya çıkarırken, Yam ve ark. birden fazla numunenin test edilmesinin RT-PCR testinin hassasiyetini önemli ölçüde maksimize edebileceği sonucuna varmıştır.

Bu bulgular, tanı potansiyelini en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiş koşullara sahip nükleik asit bazlı kitlerin uygulamada oldukça önemli olduğunu göstermektedir. Özellikle, noninvazif tükürükte  etkili SARS CoV-2 nin tespiti, genel halk tarafından yoğun şekilde kullanılabilen uygun fiyatlı hasta başı test kitlerini geliştirebilmek için de uygun bir yol olabilir.

Doğru ve hızlı teşhisin önemi; nükleik asit bazlı yöntemler(PCR) ve immünoassay yöntemleri de içeren SARS-CoV-2 tespiti için kullanılan tanı kitlerinin önemini ortaya koyar. COVID-19’un epidemiyolojisi ve mevcut tanı kitlerinin özellikleri göz önüne alındığında, erken safhada bir miktar yanlış pozitif seviye (yani, azalmış özgüllük) pahasına yanlış negatif sonuçları (yani artan hassasiyet) azaltmak çok önemlidir. Salgının sonraki aşamalarında, özellikle toplum “evde kal” aşamasından “yeni normal” aşamasına hazır olduğunda, yanlış pozitifliği azaltmak önemli hale gelir.

Nükleik asit bazlı tanı kitleri, özellikle RT-PCR, yüksek hassasiyetleri ve özgüllükleri nedeniyle bu gereksinimlere şimdiye kadar en iyi çözümleri sunsa da daha ucuz fiyatları, daha basit operasyonları ve daha hızlı tespit süreleri sayesinde immünolojik testlerin önemi fazladır. İmmünolojik testler, COVID-19’dan kurtulan kişilerin topluma yeniden dönmeleri için virüs salgınının sonraki aşamalarında özellikle yararlıdır.

Dr. Eda Yorulmaz

Kaynaklar:
1- Molecular and Serological Assays for SARS-CoV-2: Insights from Genome and Clinical Characteristics Jiping Shi, Dongsheng Han, Runling Zhang, Jinming Li, Rui Zhang Clinical Chemistry, Volume 66, Issue 8, August 2020, Pages 1030–1046, https://doi.org/10.1093/clinchem/hvaa122
2- https://labtestsonline.org/tests/coronavirus-covid-19-testing
3- AACC.org // Clinical Laboratory News
4- https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance
5- https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/multiplex-primer-probes.html
6- WHO-2019-nCoV-laboratory-2020.6-eng.pdf
7- 200806_eul_pqt_ivd_question_and_answer_doc (1).pdf
8- Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Yayınları COVID-19 -2020
9-Detecting the Coronavirus (COVID-19) Pravin Pokhrel, Changpeng Hu, and Hanbin Mao*
10- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7366507/pdf/se0c01153.pdf
11- KLİMUD-Yetkilendirilmiş Covıd-19 Laboratuvarlarında Yaşanan Deneyimler 11.09.2020 Web Çalıştay Raporu